Il percorso – della durata di 55 minuti – prende avvio dal Cortile della Dogana per concentrarsi sul Salone dei Cinquecento, si snoda tra le monumentali stanze dedicate agli Dei Terrestri e agli Dei Celesti, che celebrano le gesta dei personaggi Medici e delle divinità mitologiche e prosegue negli appartamenti della Duchessa Eleonora di Toledo, esplorando anche le “mai viste” camere del Duca e dei Signorini.
Poi si passa nella Sala delle Udienze e nella Sala dei Gigli e si conclude il tour nella Sala delle Carte geografiche, straordinaria testimonianza della conoscenza del mondo nella seconda metà del Cinquecento.
Spettacolari inserti sono le ricostruzioni 3D: vengono riproposte la fastosa festa per le nozze di Francesco I de’ Medici e Giovanna d’Austria, la fontana di Bartolomeo Ammannati per il Salone dei Cinquecento e la Camera Verde, chiamata così perché in origine somigliava a un illusivo loggiato aperto su paesaggi verdeggianti.